经典三级视频在线观看 噬菌体DNA/RNA结合性筛选的标准程序

A.噬菌体的制备
1．将新鲜的或冰冻保存在细菌中的文库储液（实验方案9．2）转接入200m1含有15ug/m1 的四环素的2×TY培养基中。我们通常转接超过文库容量约10倍数目的有活性的细菌细胞，以确保文库的多样性得以保持。可以通过把一系列的稀释液涂布在合适的平板上培养的方法，测定冻存液中有活性细胞的浓度。
2．以250r/min的速度振荡菌液，30℃培养16小时。
3．3700g离心过夜培养的菌液15分钟，以制备噬菌体上清液。取出并保留上清液，于4℃保存。滴定上清液。

B．筛选
1．合成需要的靶标DNA或RNA寡核苷酸，其中一组是5’端连接*的寡核苷酸链。为dsDNA位点合成一条不联结*的互补副链。
2．①对于DNA位点的筛选，将每条寡核苷酸链各取10u1，与20/A1的2X核酸退火缓冲液混匀，让两条互补的寡核苷酸退火。在PCR仪中以94℃加热样品3分钟，然后以每分钟2℃的速度冷却至4℃。冷却后，用水将溶液稀释至1pmol/L的终浓度，于-20℃保存。②对于RNA位点筛选，用RNA折叠缓冲液（1XCM）配制1pm01/L的寡核苷酸溶液。将溶液加热至95℃，然后缓慢冷却至室温，以使RNA折叠。对于有些位点，“突然”冷却至4℃可能折叠效果更好。将RNA溶液保存在4℃（虽然有些位点能成功地冰冻—解冻）。
3．将*联结的靶标位点（通常是1pmol）加入50,ulPBS缓冲液，加入到链亲和素包被的小管内。将小管于20℃放置15分钟。 。
4．将1m1含4％（w/v）脱脂牛奶的PBS缓冲液加入小管，以封闭非特异性结合位点。将小管于20℃放置1小时。
5，将噬菌体上清液以1：10稀释于1ml含有2％（w/v）脱脂牛奶、1％（体积分数）Tween-20及20ug /ml超声破碎鲑鱼精DNA的PBS缓冲液中。为了提高筛选的特异性，加入与靶标同源的寡核苷酸竞争剂。加入与*联结的靶标相比过量达100倍的竞争剂。
6，弃去核酸包被的小管中的封闭缓冲液，加入1ml稀释过的噬菌体上清液。小管于20℃放置1小时。
7．将结合混合物弃去，用含2％（w/v）脱脂牛奶和l％（体积分数）Tween—20的PBS缓冲液洗涤20次，再用PBS缓冲液单独洗涤一次。
8，加入100/A1 0．1m01/L的三乙醇胺并放置15秒，以洗脱保留的噬菌体。将溶液转入一个新的小管中，并立即用等体积的1mol/LTris—HCl（pH 7．4）进行中和。
9．将过夜培养的菌液以1：100接种于2×TY培养基中，37℃培养约2小时以制备处于对数生长期的大肠杆菌TGl菌液。菌种必须源于M9小化琼脂培养基平板上生长的克隆，这样才能保证F，纤毛的表达，因为这是噬菌体感染所必需的。
10．用50ul洗脱的噬菌体感染0．3m1处于对数生长期的大肠杆菌TGl菌液，混匀后37℃静置培养1小时。
11．将感染过的菌液转入2～5ml含有15/Ig/m1的四环素的2XTY培养基中。 以250r/min的速度振荡菌液，30℃培养16小时，为随后几轮的筛选制备噬菌体。
12．重复从步骤2或3到步骤12的筛选程序3～5轮。在后一轮筛选后，将感染的细菌 涂布在含15ug/m1的四环素的TYE琼脂培养基平板上。这时筛选出的克隆已准备好，可用于通过序列测定和ELISA进行的进一步的鉴定。