经典AV三级在线观看 制备scFv接头DNA

[方法]
1．在0．5ml微量离心管内配制用于扩增的主混合液。所显示的主混合液用于VH—Vκ接头。对于VH—Vλ接头的主混合液，n＝29。
单个反应主混合液/ul （n＝25）
● 水 37 925
● 10×Vent缓冲液 5．0 125
● 20×dNTPs 2．5 62．5
● Vent DNA聚合酶 0．5 12．5
2．取24支0．5ml试管，每管分别加入RHuJH引物和RHuVκ引物，各2ul。RHuJH引物和RHuVκ引物共有24种可能的结合形式。而对于VH—Vλ接头，则用RHuVl引物替代RHuVκ引物即可，共可编为28管。如无加热盖，可以加入l滴轻质矿物油覆盖反应液。
3．设1个阴性对照管，加入50ul主混合液。
4．每个样本取1．0ul scFv基因模板（约1ng），加入到主混合液中。
5．取46u1主混合液分别加入到步骤2已制备的24个管内。
6．预加热PCR反应格到94℃。
7．以94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃1分钟的条件共循环25次，扩增接头序列。
8．将PCR产物用2．0％TBE琼脂糖胶电泳纯化，切取PCR产物；用Geneclean抽提，并重悬DNA于50ul水中。