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洗涤是ELISA不同于均相免疫学检测技术的一大特征，洗涤在整个ELISA反应过程中虽不是一个反应步骤，却非常关键。其目的是去除反应体系中与反应无关的成分，包括未结合的酶结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。
洗涤液通常为含有一定浓度Tween 20 的缓冲液，Tween 20 是一种非离子去垢剂，既含亲水基团，又含疏水基团，在洗涤中的作用机制是借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白分子与固相的吸附。同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促进蛋白质分子脱离固相而进入液相，最终被洗脱。必须注意非离子去垢剂的使用浓度，zui常用的洗涤液是含0.05 %Tween20，pH为中性的磷酸盐缓冲液，如果洗涤液中的Tween20 超过0.2% ，可使包被于固相上的抗原抗体解吸附而影响实验的测定下限。
洗涤可采用洗板机或手工洗涤两种方式，手工洗板则分为浸泡式和流水冲洗式洗涤。无论洗板方式如何，在向板内注液时应当避免气泡残留孔内，否则会因洗涤液难以进入孔中而影响洗涤效果。在采用洗板机洗板时，要保证洗板机上的每个吸液针都能一致地插入板孔底部将洗液wan全吸净，要求洗板后残液小于2 μL，即人工扣板垫纸不湿，浸泡时间超过45 s。
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